05版药典微生物限度检查法操作要点

（广东省药品检验所林丽英 ）

05版药典微生物限度检查法与以往药典的最大不同就是多了方法验证。由于以前版本的药典没有要求对检验方法进行必要的验证，所以大家都觉得不好理解、不好难操作。为了更好执行05版药典，现根据我的理解，对药典上的各种检验方法在验证时的操作要点与大家作个探讨。

一、验证的目的 由于制剂在投料和加工过程中，或有抑菌成份存在，或由于各种成份相互作用的结果，将可能对某些类型的微生物的检出产生影响。对所建立的微生物限度检查法进行验证的目的，就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺利的检出样品中污染的各种类型的菌。

细菌计数验证所用的菌株：

大肠埃希菌[CMCC（B）44102]：代表革兰阴性菌；

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]：代表革兰阳性球菌；

     枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]：代表革兰阳性杆菌；

霉菌计数验证所用的菌株：

白色念珠菌[CMCC（F）98001]：代表酵母菌；

黑曲霉[CMCC（F）98003：代表霉菌；

由于每个菌株代表不同类型的菌，所以只有这五个菌株的回收率均达到要求，才表明样品中污染的各种类型的菌都可能检出来，否则，所得的结果是不能真实地反映样品的污染情况的。

菌液的制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～l00cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出胞子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～l00cfu的孢子悬液。

二、方法的验证

所有验证方法的操作均应在阳性接种间。

（一）、细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证 验证方法 取试验可能用的最低稀释级供试液进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。

1．常规法 就是取1:10的供试液1ml和50~100个试验菌株加入到1个平皿中，立即倾注相应的琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，培养，计算各菌株的回收率。 常规法做一个样品的细菌、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢？ 试验组：5×2=10个，即每个菌株做2ml共需10个； 菌液组：5×2=10个，即每个菌株的加菌量，每株2个皿。 共24个 本底菌组：2个细菌计数，2个霉菌和酵母菌计数。 细菌计数验证所用的平皿共14个，其中6个用于试验组计数，6个用于菌液组计数，2个用于细菌本底菌计数，倾倒营养琼脂培养基；霉菌和酵母菌计数所用的平皿共10个，其中4个用于试验组计数，4个用于菌液组计数，2个用于霉菌本底菌计数，倾注玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）。 回收率=[(试验组菌数-本底菌组菌数)/菌液组菌数] 当大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌3个菌株的回收率均达到70%以上时，细菌计数用该验证的方法检验。 当白色念珠菌和黑曲霉2个菌株的回收率均达到70%以上时，霉菌计数用该验证的方法检验。

2．培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每lml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为lml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 具体操作：（以1ml分至5个皿为例） 就是取1:10的供试液1ml均匀分注到5个平皿中，每个皿0.2ml，每株试验菌平行制备2ml的平皿数，然后加入相应的琼脂培养基，培养，计算各菌株的回收率。 用该法做一个样品的细菌、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢？ 试验组：5×10=50个，即每个菌株做2ml共需50个； 菌液组：5×2=10个，即每个菌株的加菌量，每株2个皿。 共80个 本底菌组：10个细菌计数，10个霉菌和酵母菌计数。

3．离心沉淀集菌法 取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟(供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心) ,弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。然后用此稀释液进行检验。

4．薄膜过滤法 取相当于每张滤膜含1g或lml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或lml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液lml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或真菌琼脂培养上。每种菌株至少制备一张滤膜。即每个验证样品至少制备7个膜。（5个试验组和2个本底菌）

（二）控制菌检查方法的验证 验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。

菌种 对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。 大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44 102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC(B)26 003) 乙型付伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)(CMCC(B)50 094) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugmosa)(CMCC(B)10 104) 生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)(CMCC(B)64 941) 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为10~l00cfu的菌悬液。

验证方法

（1）试验组 取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

（2）阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。 结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

①避免将抗生素用于单纯的咳嗽和感冒；
  ②避免用抗生素来治疗病毒感染，如病毒性咽炎；
  ③对于健康妇女的非复杂性膀胱炎，抗生素限制使用三天；
  ④限制使用电话开抗生素处方，特殊情况例外；⑤窄谱抗生素可奏效的情况下不用广谱抗生素；⑥抗生素处方应尽可能以细菌培养和药敏的结果为依据；  
  ⑦在治疗过程中应根据需要修改抗菌治疗方案；
  ⑧外科预防性使用抗生素，要根据抗生素药理、药代的特点以及目标病原菌的不同，选用合适的抗生素，确定合理的给药时间和给药期间；
  ⑨使用抗生素治疗细菌感染时，要防止细菌尚未完全清除的情况下过早的停用，亦要避免在没有督察的情况下长时间滥用；
  ⑩在选用抗生素时要考虑价格/效力比。

供参考,请补充....

当一种习惯使用的抗菌药物使用较长时间后，由于耐药菌的产生使得该药的临床效果明显降低时，可考虑在一段时间内停用该抗菌药，而换用另一种临床有效药物。其结果不仅临床上疗效提高，而且耐药菌株也会明显减少，包括对所替换的药物的耐药菌也会减少，这是目前国际上控制和预防耐药菌产生的一种有效方法。

手术预防用药的选择：
了解手术部位常住菌
所选药物的抗菌谱要覆盖该常住菌
所选药物的不良反应小
于切皮前30min静脉给药，血药浓度要在手术全程（特别是最初3h）应高于常住菌的MIC90