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利用pGenesil-1质粒构建表达载体可研究基因功能

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  • TA的每日心情

    2018-7-26 15:32
  • medicilon 发表于 2019-12-18 09:23:54 | 显示全部楼层 |阅读模式
    pGenesil-1质粒是以pEGFP-C1质粒为骨架改造获得的,可以用于哺乳动物表达载体的构建。pEGFP-C1载体容易转染真核细胞,而且对目的蛋白的生物学功能和宿主细胞的生长没有影响,其中的报告基因绿色荧光蛋白有利于示踪和检测所克隆的目的基因,并且荧光蛋白稳定表达。当目的基因抑制不采用常规的荧光检测时,编码shRNAs的pGenesil-1质粒是较好的选择。

    RNAi(RNA干扰)指的是在进化过程中高度保守的、由RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象,使用RNAi技术可以特异性减弱特定基因的表达,以便于研究该基因的功能。实现RNA干扰可以采用体外转录法、载体表达法以及化学合成法等。有研究发现利用pGenesil-1构建的癌基因干扰载体可以成功降低癌基因的表达,适用于该基因功能的研究。

    pGenesil-1质粒可以用于哺乳动物表达载体的构建,pEGFP-C1质粒广泛用于哺乳动物细胞已经多年,它具有荧光蛋白表达,非常方便导入效果的检测。

    构建一种高效稳定的哺乳动物细胞表达系统,并应用高效的哺乳动物表达载体,将目标基因在合适的哺乳动物宿主细胞株中进行高效表达,可以显著提高目标基因在宿主细胞中的表达水平,同时大大减少筛选高表达细胞株的时间和成本,实现目标蛋白在哺乳动物细胞中的高产量稳定表达。美迪西科研人员建立了成熟的哺乳动物蛋白表达系统及纯化服务平台,提供哺乳动物蛋白表达系统的表达与纯化服务。

    利用质粒构建干扰载体,可以确保后续实验方便、快速展开。具体做法是构建shRNA的质粒表达载体,转染目的细胞,使之在细胞内转录生成shRNA,利用细胞的Dicer酶作用个,生成siRNA发挥作用。maspin基因是一种肿瘤抑制基因,参与细胞外基质降解。体外细胞实验发现,前列腺癌与乳腺癌细胞株中,maspin基因显示出抑制肿瘤细胞侵袭与运动的能力,在动物肿瘤模型中可以降低癌细胞株转移的能力。

    有研究者构建了maspin基因shRNA真核表达载体,为进一步研究该基因在胃癌细胞株MKN-28生长、浸润、转移中的作用奠定基础[1]。研究者设计合成针对maspin基因的shRNA与表达绿色荧光蛋白的pGenesil-1.1质粒连接,构建的重组质粒分别命名为阳性质粒maspin/pGenesil和阴性质粒YX/pGenesil。分别用RT-PCR和Westernblot检测转染重组质粒前后胃癌细胞株MKN.28maspin的表达变化。
    结果通过凝胶电泳和DNA测序分析,成功构建针对maspin特异性shRNA真核表达质粒maspin/pGenesil及YX/pGenesil。该研究成功构建了重组质粒maspin/pGenesil,经转染能有效抑制人胃癌细胞株MKN.28maspin基因的表达。

    也有研究者构建了表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147,EMMPRIN)基因序列特异性的短发夹样RNA(shRNA)载体[2]。研究者根据CD147基因序列及shRNA设计原则,化学合成两段编码短发夹RNA寡核苷酸序列,将其定向克隆到pGenesil-1.1质粒表达载体中,重组构建RNAi质粒,并对重组质粒进行酶切分析。

    结果限制性内切酶Eco31I和SacI酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1.1质粒载体中,酶切结果证实插入片段与设计序列完全一致,成功构建针对基因CD147的shRNA质粒表达载体。该研究成功构建了人CD147基因重组载体,为研究CD147蛋白的生物学效应和骨肉瘤的治疗提供实验依据。

    pGenesil-1质粒可以构建哺乳动物表达系统,将其应用在构建某个基因的表达载体上面,是该基因在细胞系中稳定表达,为研究该基因的的生物学活性提供了研究基础,因此pGenesil-1质粒在基因功能研究中作用较大。

    [1] shrnamaspin/pgenesil-1.1表达载体的构建及意义[J].

    [2] CD147 shRNA质粒表达载体的构建及鉴定[J].


    临床药师网,伴你一起成长!微信公众号:clinphar2007

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    cry
    还木有人打赏~
  • TA的每日心情

    2020-3-9 08:57
  • pengli883 发表于 2019-12-24 14:51:20 | 显示全部楼层
    临床药师网,伴你一起成长!微信公众号:clinphar2007
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