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浅析检测Caspase-3活性在细胞凋亡实验中的作用

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  • 2018-7-26 15:32
  • medicilon 发表于 2019-10-12 09:35:29 | 显示全部楼层 |阅读模式
    与细胞凋亡密切相关的Caspase家族是一组高效蛋白水解酶,通过激活Caspases可以实现细胞的凋亡,其中Caspase-3是最为关键的效应蛋白酶。在各种因素启动的凋亡程序中器最后枢纽的作用。在生物实验服务中,Caspase-3可以作为细胞凋亡的指示剂,通过检测其活性强弱可以判断细胞的凋亡情况。在基因敲除实验和临床前动物实验中的研究发现,阻断Caspase活性即可阻滞体外和体内的细胞凋亡,因此检测Caspase-3活性还有助于指导Caspase-3抑制剂的研发。

    细胞凋亡又称为程序性细胞死亡,是细胞由基因控制的有序的死亡。核酸内切酶的激活是判断细胞凋亡的一项重要生化指标,也是凋亡细胞最具有特征性改变指标。当受到凋亡信号刺激时,Caspase被激活,并引发Caspase级联反应,通过裂解特异性底物及激活内源性核酸内切酶,使细胞呈现典型的凋亡形态学和生物化学特性。广泛地表达于淋巴结、骨髓、上皮等多种正常组织中的Caspase-3,在恶性肿瘤组织中也有表达,被称为死亡蛋白酶,其活化标志者凋亡进入不可逆阶段,在细胞凋亡机制中居于重要地位。

    1、Caspase-3的活性检测可以判断细胞凋亡情况

    Caspase-3经过细胞外途径和细胞内途径来介导细胞凋亡,细胞外途径或称为死亡受体途径,细胞内途径或称为线粒体途径。Caspase-3活性检测和表达在生物实验服务中,常作为细胞凋亡检测的方法。在细胞凋亡实验中检测Caspase-3活性的方法主要有Western blot 分析、荧光分光光度计分析和流式细胞术分析等。

    Caspase-3的高表达与细胞凋亡有很大的关系,如有研究者检测Caspase-3、Caspase-8在非酒精性脂肪性肝炎中的表达,探讨其在肝炎中的临床意义[1]。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)又称代谢性脂肪性肝炎,是非酒精性脂肪性肝(NAFL)的进一步进展,病理变化与酒精性肝炎相似。美迪西在NASH新药评价方面具有丰富的经验和有效的动物模型,包括高脂饲喂诱导的金黄地鼠、大鼠模型,MCD饲料诱导的小鼠模型等,并且具有针对NAFLD纤维化阶段的有效评价模型。

    有研究者应用免疫组化方法和原位末端标记技术(TUNEL实验)分别检测50份肝炎肝组织和15份正常肝组织中Caspase-3、Caspase-8表达和细胞凋亡[1]。结果发现 Caspase-3、Caspase-8在非酒精性脂肪性肝炎中的表达(82.0%、82.0%)分别高于其在正常肝组织中的表达(18.8%、13.3%),差异有统计学意义,并与肝细胞凋亡密切相关。Caspase-3、Caspase-8在非酒精性脂肪性肝炎随病理损伤程度加重阳性表达率增高,差异有统计学意义。Caspase-3、Caspase-8在非酒精性脂肪性肝炎中的表达与谷丙转氨酶水平比较差异无统计学意义。因此 Caspase-3、Caspase-8参与非酒精性脂肪性肝炎肝细胞凋亡的发生,并参与非酒精性脂肪性肝炎的发病过程。

    2、Caspase-3活性检测可以指导Caspase-3抑制剂的研发

    Caspase-3是细胞凋亡途径中重要的靶蛋白,研究Caspase-3抑制剂或激活剂,对治疗心脑血管疾病、肿瘤等具有积极意义。如有研究者利用原核表达系统高效表达Caspase-3,并以表达的粗酶构建基于Caspase-3抑制剂的体外高通量筛选模型[2]。随后对实验室保存的960种放线菌次级代谢产物进行筛选,获得9株具备分泌Caspase-3抑制剂活性的菌株。经过进一步复筛,确认了2株具备分泌高活性的Caspase-3抑制剂的菌株pwh890和pwh891,均可抑制80%的Caspase-3活性。最后对pwh890分泌的次级代谢产物进行初步分离纯化,获得31.3mg纯度较高的抑制剂,为后续的抑制剂的结构解析和改造奠定基础。

    Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。还有研究发现Caspase-3有望成为治疗异常凋亡引起的神经退行性疾病、心脑血管疾病、风湿性关节炎等疾病的靶点,阻断Caspase-3活性将成为阻止细胞凋亡的重要新药,因此在细胞实验中,检测Caspase-3活性具有重要意义。

    [1] Caspase-3和Caspase-8在非酒精性脂肪性肝炎中的表达及其意义[J].

    [2] Caspase-3抑制剂的筛选体系构建及药物筛选[J].


    临床药师网,伴你一起成长!微信公众号:clinphar2007

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    cry
    还木有人打赏~
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