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在转基因植物中使用乙醇可以进行重组蛋白表达优化

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  • 2 小时前
  • medicilon 发表于 2018-6-12 15:38:58 | 显示全部楼层 |阅读模式
    重组蛋白是现代生物技术生产的最重要的产品,它是以基因工程和细胞工程等技术生产的、源自生物体内的蛋白药物。一些医药研发公司提供的重组蛋白表达服务是可以帮组客户获得高表达的重组蛋白,重组蛋白疗效确切、作用显著,对某些疾病具有不可替代的治疗作用。

    重组蛋白生产大量依赖于各种生物合成体系,包括生物工程大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等,其生产体系选择、载体构建、参数优化、分离纯化、活性检测等各个步骤的成功确定都是长期理论指导、经验总结与实际试验的共同结果。美迪西生物医药提供重组蛋白表达服务,拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统等。

    由于“生长”阶段和“生产”阶段可以被分开,所以重组蛋白的可诱导性表达可以对产量进行优化。虽然已经开发了各种针对于植物的可诱导性表达体系,却没有一个可以同时满足在非诱导状态下具有低表达背景以及诱导时具有高产量的要求。Stefan Werner等人报道了一种新颖的乙醇可诱导的体系,以用于在转基因植物中表达重组蛋白。

    在植物中要得到高产量的重组蛋白可以通过许多表达体系来实现。然而这些体系均只能提供部分的解决方案,并不能用于工业制造。例如,已经有报道在种子内进行核内转基因的话可以从每kg种子中生产得到最多10g重组蛋白。然而实际的产量是相对较低的,因为种子的收获量要比绿色生物量少得多。

    此外,重组蛋白还可以在叶绿体中表达,产量可以高达可溶性蛋白总量的50%,该体系的主要限制是在质体中合成的蛋白不能被糖基化,这会妨碍它应用于生产许多有用的医药蛋白。还有,研究者发现了一个基于从病毒RNA复制子上表达的瞬时表达体系,可以从每kg新鲜绿叶中生产得到最多5g的重组蛋白,这一产量已经接近蛋白表达的生物极限。然而这一体系需要特殊的仪器设备,因此对于大规模应用而言是很昂贵的。为了实现在未诱导状态下对表达进行控制,现有所有体系都依赖于一个修饰过的组成性启动子来进行表达。不幸的是,这些体系的表达量即使是在诱导情况下也不高。如果使用未修饰的启动子的话,不需要诱导就能很容易地达到这样的表达量。因此,对于可诱导体系而言,重组蛋白产量不足是主要的问题。

    最初,Werner等人使用了一个烟草花叶病毒的载体。它包含有几个内含子,用于改善病毒RNA的核运输。虽然缺失编码外壳蛋白的基因,该载体还能进行复制并在细胞间移动。病毒复制子的表达受Aspergillus nidulans乙醇脱氢酶(alcA)启动子的调控,该启动子可以通过加入乙醇来激活。

    由于在转化过程中叶外植体内病毒载体的背景性释放,导致这一载体不能在Nicotiana benthamiana中实现稳定的转化。所以该病毒载体被进行解构,使得负责在细胞间运动的病毒移动蛋白(MP)处在病毒复制子的外面,并依然受alcA启动子的控制。由于MP不再是病毒复制子的一部分,所以只在原先被转染的细胞内表达。而复制子的移动也被限制在临近转染细胞的1-2层细胞内。然后载体就被转染到N. benthamiana中,并通过乙醇诱导对后代进行筛选。具有最高表达量的植物就被选择出来。

    Werner等人还对诱导条件进行了优化。用高达20%的乙醇进行单次喷洒是不足以产生诱导作用的。用4%的乙醇进行重复喷洒可以使叶子中产生均一的表达,但是却发现表达只限于接触到乙醇的细胞。用最多4%的乙醇进行灌根被证明能有效诱导在茎部和主要叶脉中的表达,更高浓度的乙醇对植物是有害的。将植物在乙醇蒸气中培育24h可以进一步改善表达量。

    乙醇诱导后还对重组蛋白表达的过程进行了监测。植物的地上部分在液氮中被磨碎,蛋白被提取出来后用SDS-PAGE和荧光光谱法进行分析。诱导后两天就可以检测到GFP荧光,这与凝胶上27 kDa处出现的强条带是一致的,诱导后五至七天的时候可检测到最高的表达量。GFP最终的表达量可以达到2.7-4.3 mg/g 诱导植物鲜重,这与magnifection体系的产量是可比的(3.3-4.1 mg/g 鲜重)。在转基因植物中,诱导后表达量的相对增加可以使用抗GFP抗体进行免疫印迹来确定。GFP在诱导植物提取物的1/5000稀释液中还能被检测到。在四株没有诱导过的植物中,只有一株显示了较弱的信号,其强度与诱导植物1/5000稀释液的信号强度一样强。因此,背景表达是很低的而诱导可以使表达量增加至少5000倍。

    总的来说,这一乙醇可诱导的体系展示了可忽略的背景表达、高诱导倍数和诱导后重组蛋白的高水平表达。此外,该过程可以很容易扩大规模。因此,这一技术对于在植物中进行重组蛋白表达是极其有用的,并可以用于工业制造。

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    cry
    还木有人打赏~
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