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[药物试验] 浅析生物活性检测的3种方法

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  • 2018-7-26 15:32
  • medicilon 发表于 2018-6-12 13:55:59 | 显示全部楼层 |阅读模式
    不同的细胞因子有其特有的生物学活性,细胞因子的生物活性检测是利用细胞因子对特定细胞株(靶细胞或反应细胞)的生物学效应来评估样本中相应细胞因子的含量或活性。有以下3种方法可进行生物活性检测。

    1、四唑盐(MTT)比色法

    MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。此法的原理是:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物,并沉积在细胞中,而细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物,用酶联免疫检测,以在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
    用此法测细胞活力,为保证结果的准确性,最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,再确定每孔细胞接种数和培养时间,以保证培养终止时不会过满。另外,实验时设空白对照,比色时,以空白孔调零。

    该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

    2、细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法):

    也称考马斯蓝染色法,基本原理为考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合,在595nm波长处呈最大吸收,其OD值与蛋白质含量成正比。此种方法主要用于测定受体及细胞外代谢物的特异性活性,是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

    考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465 nm变为 595 nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。

    考马斯亮蓝染色法的突出优点是:

    (1)、灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
    (2)、测定快速、简便,只需加一种试剂,完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
    (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

    此法的缺点是:

    (1)、由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
    (2)、仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。

    3、细胞蛋白质合成测定法(3H-亮氨酸掺入法)

    基本原理为:细胞在合成蛋白质时需要摄取外源性氨基酸,用同位素标记氨基酸如3H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白合成代谢中,通过测定细胞的放射性强度,可了解细胞蛋白质合成代谢情况。
    (1)、取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,悬浮于含10%胎牛血清的RPMI培养基中,调整细胞密度107-109个/L,接种于24孔培养板,每孔1ml。
    (2)、将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞处于对数生长期时,每孔100ul预温37℃的3H-亮氨酸。
    (3)、继续培养4-24h。
    (4)、终止培养,取出培养板,小心吸取培养上清,用预冷的PBS洗涤,晾干。如果细胞松散,可先用甲醇固定10min。
    (5)、把培养板放在冰盖上,每孔加1ml 10%三氯醋酸(TCA),在4℃放置10min,吸取上清。
    (6)、甲醇洗涤、晾干。
    (7)、每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH,1%SDS,室温下放置30min。
    (8)、混匀,移入闪烁液,用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm),以cpm/106细胞或cpm/mg蛋白表示。 对悬浮生长的细胞则采用离心法处理。

    用生物学活性检测法得到的细胞因子含量一般以活性单位来表示,生物活性检测法敏感性往往高于细胞因子的免疫学检测法,且不需要各种标记的特异性抗体,可直接反映待测细胞因子的活性水平。        美迪西合成的化合物活性测定一般在初筛活性的纯度能达到95以上,对于后期需要动物试验或者重复初筛实验,化合物活性测试纯度能达到98以上,常用的检测方法:酶标仪、测量OD值、做生长曲线等。


    临床药师网,伴你一起成长!微信公众号:clinphar2007

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    cry
    还木有人打赏~
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