痰液细菌学检验的标准化操作程序

1前言   
       众所周知，传统习惯程序的痰标本细菌学检验其临床符合率并不高,其原因是多方面的。除了痰标本采集不规范导致的不合格标本带来的培养结果与病人感染不相符外，还因为微生物和人体的相关性本身就具有复杂性：源自细菌的致病与条件致病的辨证性，如致病菌可能为正常携带，而细菌在肺通气功能异常病人的下呼吸道的可以发生单纯定植或感染，要证明培养结果与感染的相关性是医学微生物学所面临的难题，这也使得一直以来在对于痰培养的标准化进展十分缓慢，以至在各版《全国临床检验操作规程》上也未提出相应详细可行的令全国同行公认的统一规范的标准化操作程序（SOP）和完整的痰液培养的质量控制办法。习惯程序的痰标本细菌学检验的缓慢也很不适应临床诊断治疗的迫切性[1]。故而，建立规范而快速的痰液细菌学检验的SOP对于提高呼吸系统感染病的诊治水平和控制抗生素的滥用等问题均有重要的作用  
        痰培养阳性率普遍教低，临床符合率差的关键因素是痰标本采集不规范，不合格痰标本将直接导致病原菌被分离的机会降低，大量正常菌群也会抑制病原菌的生长或干扰病原菌的检出，降低了临床符合率；再有就是操作程序的不规范，不重视直接涂片，检验过程控制的不严密也是导致临床符合率低的重要原因。我们通过SOP的临床应用情况的分析，痰培养阳性率和临床符合率均可能被提高，并且细菌分布统计结果显示本文与国外文献所报道的情况基本一致[2]。  
对于直接涂片的意义，在于判断标本中微生物有无、类型、染色特性、形态特征，标本的污染情况，还可对痰标本中可能的病原菌初步诊断(依据人体被病原菌感染后的炎性渗出包裹和白细胞吞噬反应)，判断是否存在复数菌感染，动态观察处于治疗过程中不同时期所送检的标本中病原菌情况的变化（如同种病原菌数量的增减，机体的免疫反应，菌群的交替）。甚至可以推断临床治疗疗效和病人病情的变化和转归，医院内感染的发生等，具有重要意义[3]。  
为了满足高质量需求，对首代分离培养基应该进行严格的质量控制[4]。另外，对首代分离培养基的选用和搭配的合理化也需要进行探讨。  
        为了缩短鉴定时间，在细菌鉴定中可采用酶法鉴定：所谓酶法鉴定：国外八十年代中一些微生物学家在研究中发现由于细菌在生长分裂过程中细胞内集聚了大量的与物质代谢相关的各种酶类，可在短时间内释放到胞外（称胞外酶）可迅速分解相应底物。故而，当在高灵敏微量生化反应培养基中加入大量浓厚的菌液时，则无须细菌繁殖就能在短时间内产生反应。根据这一理论采用高灵敏微量生化反应单元与数值分类法相结合而成的酶法生化编码鉴定系统可对细菌进行快速鉴定（如API rapid 20E/NH 11n、Sensititre AP80、MicroScan Rapid Neg ID3、Vitek GNI+、RapID onE、超声波辅助快速酶法革兰阴性杆菌鉴定系统[5~14]），鉴定时间可缩短至4~6小时。但链球菌因为首代分离生长慢，菌落细小，不能收集充足菌量，暂不能采用酶法鉴定，其鉴定仍沿用常规生化反应鉴定或免疫学方法鉴定.  
2 标准化操作程序  
2.1标本接收筛选方案：  
目测：黄色、灰色、血性、铁锈色，浑浊、 稠厚，呈现团块状的标本为合格标本；  
而无色透明、有灰白片状物或黑色小点，有明显食物渣滓、纸屑灰尘的为不合格标本。  
显微镜下筛选：对经过目测筛选的标本，在洗涤前还须再经过显微镜下筛选：取约  0.1ml痰液（黄豆大小）用接种环均匀涂布成2×2cm2大小的涂膜，在显微镜下，凡脓细胞>25/LP且鳞状上皮<10/LP的标本为合格标本，可进入下一步程序；而脓细胞<10/LP但细菌数量>+++或鳞状上皮>25/LP的标本为不合格标本，应拒收。  
2. 2标本预处理：

        按《全国临床检验操作规程》（第2版）相关章节，采用先用20ml生理盐水洗涤两次，经过10ml生理盐水稀释后，加入1%的PH7.6的胰蛋白酶溶液消化90min后接种。并同时在洗涤后制作原始痰涂片，进行染色镜检。  
2. 3读片：根据人体对细菌/真菌感染在早期主要以非特异性免疫的细胞免疫为主的特点，结合呼吸系统生理病理特点，阐述痰液形成过程和排出过程，我们可以得知，在下呼吸道中感染中形成的炎性渗出、包裹物中存在与感染直接相关的病原菌，在自然排痰的过程中会被上呼吸道的正常菌群所污染，但污染菌位于炎性包裹物之外，且人体对正常菌群具有共生性保护因而不会产生吞噬现象，借此理论，我们将选择痰标本中脓细胞成团块状分布，集中而不稠密，且周围无鳞状上皮细胞或无大量成团状分布的细菌球的区域为读片区，认真收寻20~30个视野中脓细胞聚集处的脓细胞胞浆中有无吞噬的细菌及细菌的染色排列特征，菌体特征（如粗细、长短、扭曲）并作记录，将此作为确定病原菌的理论依据。  
2.4标本的接种培养：一般情况接种BA、Choc（含万古霉素50mg/L）、麦康凯/MecK(即“分科琼脂”NBIIA)、CHROMagar，BA、Choc置5%CO2、35℃潮湿环境培养，麦康凯/MecK、CHROMagar置普通环境35℃培养；怀疑为军团菌的加种BCYE-а培养基，怀疑为百日咳的加种Boudet-Gengou培养基，怀疑为肺结核的加种罗-琼氏培养基或采用商品化专门的分枝杆菌培养基培养；怀疑为肺炎支原体感染的加种Hayflick双相培养基或采用免疫学及分子生物学方法检测，肺炎衣原体须用免疫学或分子生物学方法。  
2.5读碟：（经过18~24h隔夜培养，但孪生球菌、营养缺陷链球菌以及分枝杆菌则需延长培养时间）  
2.5.1 G+菌：BA生长、Choc不生长、MecK不生长，——Gram染色：分G+co（革兰阳性球菌） ,G+ b（革兰阳性杆菌）  
2.5.1.1 G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形态区分:  
葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外，一般不具有临床意义；  
微球菌：黄色/白色/橙色，中等大小，较凸，规则圆形，不溶血，较干燥，不易乳化较葡萄球菌生长缓慢，该菌一般无临床意义；  
链球菌：白色/灰白色、凸起小菌落，β溶血为溶血型链球菌；灰白隆起中心扁平或凹陷，1.0-1.5mm大小的宽大а溶血为肺炎链球菌，该菌是最常见的肺部感染病原菌，在社区获得性感染中有重要的地位；细如针尖，白色凸起а溶血的为草绿色链球菌，自然咯痰标本中的草绿色链球菌一般不具有临床意义；  
肠球菌：灰白，低凸，2.0mm左右之а溶血菌落，较湿润，但一般不具有临床意义；  
口腔球菌：白色凸起较大菌落，不溶血，黏着，接种针挑之则整个菌落挑起，琼脂上不留痕迹。该菌偶尔可引起肺部的严重感染，一般好发生于COPD病人和肺气肿病人；  
孪生球菌：白色、凸起细小菌落，β溶血，生长慢48h仅0.2~0.4mm，在含羊血的MH琼脂上不生长。该菌是上呼吸道的正常菌群组成之一，一般不导致肺部感染；  
2.5.1.2 G+ b—依靠溶血特征，菌落形态、菌落大小、菌体形态区分：  
棒状杆菌：白色1.0-1.5mm左右大小，较干燥，不溶血/狭窄β溶血的为白喉或一般棒状杆菌；小而湿润，灰白/无色，半透明的为J-K棒状杆菌；灰白细小，β溶血的可能为假结核、化脓放线菌、溶血分泌杆菌；除白喉杆菌外，假结核、化脓放线菌、溶血分泌杆菌是罕见的咽喉部病源菌，棒状杆菌一般不导致肺部感染；  
乳杆菌：细小，白色凸起а溶血菌落，有特殊的酸臭味，口腔正常菌群，无临床意义；  
芽孢杆菌：灰白大菌落，表面粗糙如毛玻璃状、蜡状、边缘不规则，不同种类菌落形态差异巨大，宽大β溶血。延长培养时间，菌落从湿润变得干燥，边缘呈放射状扩散，形成叶状、掌状、雪花状、齿轮状等，常常为痰培养的污染菌；  
BA生长、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：G+co  
平面球菌、藻球菌：血琼脂上为а溶血，0.5-1.0mm大小，在Choc上呈现金属色泽，无临床意义。   
2.5.2 G-菌：根据形态分为G- b（革兰阴性杆菌） 、G-co（革兰阴性球菌） 、以及根据对特殊营养的需求对苛养性G- b进一步分类，常见的如嗜血杆菌，军团菌等：  
2.5.2.1 BA生长、Choc生长、MecK生长，——Gram染色：G- b—氧化酶、分科琼脂颜色  
肠杆菌：氧化酶（-），分科琼脂上黄色湿润大菌落；  
弧菌：氧化酶（+），分科琼脂上淡黄色扁平大菌落；  
非发酵菌：氧化酶（+/-），分科琼脂上蓝色/无色透明小菌落—鲍曼不动杆菌为中等大小，菌落聚集处产不扩散黄色色素，分离菌落为兰色；  
2.5.2.2 BA生长、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：G-co—氧化酶（+）、触酶（+）  
奈瑟菌：白色/黄色中等大小菌落，该类细菌为口腔常见正常菌群，该菌在痰培养中含量的高低反应了标本采集状态的合格程度，大量出现提示培养结果将是不可信的；   
卡他莫拉菌：白色小菌落（24h内），菌落有脆性，用接种环推之可移，是儿科和老年病人常见的下呼吸道病原菌；  
2.5.2.3 BA不生长/细小、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：G-b、菌体细小或呈扭曲之长丝状  
嗜血杆菌：灰色/无色，半透明，1.5-2.0mm的多为流感嗜血杆菌，该菌为最常见的肺部感染病原菌，可发生于各个年龄层次，其高携带与COPD发病有较强的相关性；灰色略黄，不透明，1.0-1.5mm的多为副流感嗜血杆菌。一般副流感嗜血杆菌不导致肺部感染，大量出现提示培养结果将是不可信的；  
2.5.2.4 BA不生长、Choc不生长、MecK不生长、BCYE-а生长/或在含有L-半胱氨酸、铁离子、复合抗生素选择剂的强化血琼脂上生长—Gram染色：G-b、菌体细、长丝状  
提示可能为军团菌：该菌在BCYE-а上48~72 h为中等大小扁平菌落，灰白色，较粘着；该菌具有较强的生物危险性，其中嗜肺军团菌可传染；  
2.5.3真菌及奴卡菌：BA、Choc、分科琼脂、CHROMagar均生长—Gram染色形态、生长速度  
真菌：酵母样真菌，菌落中等大小，生长快，多数可在CHROMagar上显色；大多为口腔咽喉正常菌群，一般不导致肺部感染，但免疫缺陷、糖皮质激素、长期大剂量的抗生素使用可增加该类微生物机会感染的可能性；  
烟曲霉菌，丝状真菌菌落，35℃培养24~48h时菌落为白色泛绿，72h后菌落迅速转为褐色，中心粉末状背面为黄褐色如烟熏状，该菌为肺部最常见的条件致病菌，感染时患者症状重，预后非常差；  
奴卡菌：小菌落，生长慢，菌落皱褶，呈颗粒状，有时产生褐色、黄色、黑色等色素，该类细菌可导致肺脓肿，标本脓性，有硫磺颗粒者应高度怀疑该菌；  
2.5.4肺炎支原体：固体培养基上，低倍镜或解剖显微镜下为典型“荷包蛋”样菌落，在Hayflick双相培养基的液体中使培养基变黄，该类微生物是最常见的非典型性肺炎的病原体，在社区获得性感染中有着很高的比例。  
2.6 细菌鉴定：  
在痰标本的直接涂片镜检结果的指导下进行分离鉴定：根据痰液涂片直接镜检结果中被炎性包裹及脓细胞吞噬的细菌的革兰染色后的形态特征为指引，阅读平皿中菌落形态并作菌落细菌的革兰染色，选择与镜检结果一致的细菌（该步骤应该在经验丰富的高资历微生物检验老师的带领下进行），必要时进行纯培养，再根据该细菌在各种不同培养基上的生长情况及相应菌落特征进行初步鉴定和分群，随后在细菌革兰氏染色镜检特点、触酶、氧化酶等简单试验的进一步鉴定和分群到相关的科或属后采用相应的编码鉴定系统鉴定手工或自动化鉴定，对溶血性链球菌及肺炎链球菌在生化反应的同时采用乳胶试剂作为补充。为了缩短鉴定时间还可采用具有培养鉴定一体化作用的多功能培养基[14、16]配合快速酶法编码鉴定系统进行鉴定。  
2.7 药敏试验：  
按CLSI相关规定[18~19]进行药敏试验。尚可采用特殊的药敏试验观察计算方法（如自动化仪器采用的光电浊度速率法、荧光速率法等）缩短药敏时间。也可按文献提供的方法，及时向临床提供一份快速的初步报告。  
2.8 结果报告：  
　　常规痰培养报告应包括完整的病人信息、临床诊断、抗生素使用情况（由临床医生在申请单上注明）、未染色标本直接涂片结果（有无脓细胞、脓细胞数量、上皮细胞数量、二者比例、有无真菌孢子／菌丝、有无寄生虫等）、Gram染色镜检结果（包括脓细胞数量、上皮细胞与胞外正常菌群数量与污染程度、脓细胞胞内吞噬细菌／真菌孢子的情况，炎性包裹物内细菌和真菌的存在情况、脓细胞和炎性包裹物内的细菌／真菌的染色特征、形态特征和排列特征）、所分离细菌的鉴定结果、耐药监测结果、一般药敏结果、该检验结果与临床诊断和治疗相关性的评述和建议。  
2.9 质量控制：  
为保证细菌学检验结果的快速准确和临床符合率，应对全过程进行严格的质量控制。痰标本细菌学检验质量控制包括二大部分：  
2.9.1 标本的质量控制：主要包括向临床医护人员讲授痰标本的正确性的采集方法、送检时限和注意事项，不定时的到临床调查标准化采集的执行情况，定期反馈统计信息；坚持对所送标本进行外观和镜下的初筛；坚持标本的直接涂片镜检（包括不染色标本的高倍/低倍镜湿片镜检、10%KOH透明后镜检、革兰染色后的油镜镜检）。  
2.9.2 检验过程的质量控制，这部分又包括了以下方面和步骤：  
2.9.2.1 培养基质量控制：主要是各种首代分离培养基的效果控制：包括不同培养基配制过程的标准化、质控菌株生长情况控制（应包括GI指数测定、菌落特征典型程度、而选择性培养基还应监控抑菌选择效果、菌落显色培养基还应观察菌落显色是否灵敏和鲜明），以及培养基从临床标本中分离出目的菌能力的测定。  
2.9.2.2 鉴定水平质量控制：主要是采用典型质控菌株对生化反应培养基、鉴定卡和微量生化管等试剂进行定期测试：测试项目：典型阴阳性反应、灵敏度、鉴定符合率和重复性。另外还应对技术人员的技术水平的进行不间断的再培训和不定期测试。  
2.9.2.3 药敏试验质量控制：包括对MH培养基、药敏纸片或MIC卡的质量控制，方法参照CLSI相关规定。对于MRS、ESBL、HLAR、AMPC、金属β-内酰胺酶等特殊耐药表型应坚持在18小时观察后继续培养至24小时或48小时（MRS）后复查一次。另外，在药敏试验的同时还应用接种环挑取一环菌液作划线接种，可对所配菌液进行纯培养的验证，并可同时监控菌液浓度。  
2.9.2.4 采用全程质控观点对标本进行控制：采用标本直接涂片镜检结果推断病原菌，指导分离鉴定方向；采用细菌培养特征（营养要求高低、不同选择选择性培养基生长情况及菌落特征）指导鉴定及对鉴定结果进行核查；采用鉴定结果对药敏结果进行控制或采用药敏的特殊谱型对鉴定结果进行控制（即利用已知菌对某种药物的天然耐药或天然敏感特征）[21-22]；采用对临床病历的抽样调查观察临床治疗效果，借以反馈检验结果与临床的符合率。  

3 参考文献  
3.1  过祥豹. 微生物学快速诊断法. 徐秀华主编. 临床医院感染.长沙：湖南科学技术出版社，1998.403-413.   
3.2  Karen C. Carroll. Laboratory Diagnosis of Lower Respiratory Tract Infections: Controversy and  
Conundrums .J Clin microbial, 2002,40(9):3115-3120.  
3.3 过祥豹.原始标本涂片检查对微生物检验全过程的导航作用.临床检验杂志.2002,20:25-28.  
3.4  卢先雷,喻华.改良血琼脂的评价与应用.四川卫生管理干部学院学报,2003,22(3):7-8.  
3.5  Caroline Mohr O''Hara, and J. Michael Miller.Evaluation of the MicroScan Rapid Neg ID3 Panel for
Identification of Enterobacteriaceae and Some Common Gram-Negative Nonfermenters.J. Clin. Microbiol，
October 2000， 38: 3577-3580.   
3.6  Caroline M. O''Hara, and J. Michael Miller.Ability of the MicroScan Rapid Gram-Negative ID  
Type 3 Panel To Identify Nonenteric Glucose-Fermenting and Nonfermenting Gram-Negative  
Bacilli.J. Clin. Microbiol，October 2002， 40: 3750-3752.   
3.7  Caroline M. O''Hara, and J. Michael Miller.Evaluation of the Vitek 2 ID-GNB Assay for Identification of Members of the Family Enterobacteriaceae and Other Nonenteric Gram-Negative Bacilli and Comparison with the Vitek GNI+ Card.J. Clin. Microbiol，May 2003， 41: 2096-2101.   
3.8  Ling Ling Sung, Dine Ie Yang, Chia Chien Hung, and Hsin Tsung Ho .Evaluation of autoSCAN-W/A  
and the Vitek GNI+ AutoMicrobic System for Identification of Non-Glucose-Fermenting  
Gram-Negative Bacilli .J. Clin. Microbiol，March 2000， 38: 1127-1130.   
3.9  JL Staneck, LS Weckbach, RC Tilton, RJ Zabransky, L Bayola-Mueller, CM O''Hara, and JM Miller.  
      Collaborative evaluation of the Radiometer Sensititre  
AP80 for identification of gram-negative bacilli.J. Clin. Microbiol，May 1993， 31: 1179-1184.   
3.10  TT Kitch, MR Jacobs, and PC Appelbaum .Evaluation of RapID onE system for identification of 379  
strains in the family Enterobacteriaceae and oxidase-negative, gram-negative  
nonfermenters.J. Clin. Microbiol，April 1994， 32: 931-934.   
3.11  Paul P. Bourbeau, and Barbara J. Heiter.Comparison of Vitek GNI and GNI+ Cards for Identification
of Gram-Negative Bacteria.J. Clin. Microbiol，September 1998，36: 2775-2777.   
3.12  CM O''Hara, FC Tenover, and JM Miller.Parallel comparison of accuracy of API 20E, Vitek GNI,
MicroScan Walk/Away Rapid ID, and Becton Dickinson Cobas Micro ID-E/NF for identification of  
members of the family Enterobacteriaceae and common gram-negative, non-glucose-fermenting  
bacilli .J. Clin. Microbiol，Dec 1993， 31: 3165-3169.   
3.13  S Bascomb, SL Abbott, JD Bobolis, DA Bruckner, SJ Connell, SK Cullen, M Daugherty,  
D Glenn, JM Janda, SJ Lentsch, D Lindquist, PB Mayhew, DM Nothaft, JR Skinner, GB Williams,  
J Wong, and BL Zimmer.Multicenter evaluation of the MicroScan Rapid Gram-Negative Identification  
Type 3 Panel.J. Clin. Microbiol， Oct 1997，35: 2531-2536.  
3.14  卢先雷,潘露,罗宇鹏等. 超声波辅助快速酶法革兰阴性杆菌鉴定系统的研制.四川医学,2005,26(10):1068-1071.  
3.15  卫生部医政司.全国临床检验操作规程 （第2版）. 南京：东南大学出版社，1997.  
3.16  卢先雷,喻华.革兰阴性杆菌分科琼脂的分科鉴定效果评价.全国检验医学细菌鉴定和药敏试验学术研讨会论文集,2002:158.  
3.17  卢先雷,喻华.一种新型嗜血杆菌分离培养基的评价与应用.中华检验医学杂志,2003,26(10):619.  
3.18 CLSI: Performance Standard for Antimicrobiol Disk Susceptibility Testing .2006,26(3):M100-S16.  
3.19 CLSI: performance Standard for Antimicrobiol Disk Susceptibility Testing .2007,27(1):M100-S17.  
3.20  卢先雷. 一种缩短药敏试验判读时间的方法初探. 中华医学网络杂志,2006,3(5).  
3.21  张军民. 抗生素敏感性与菌种鉴定.临床检验杂志.1999,17(6):325-326.  
3.22   马越,李景云,金少鸿.细菌耐药性监测分析中应注意的问题. 中国抗生素杂志,2005, 30(12):762-769.

学习，很需要呵！

临床药师了解痰细菌学检验的知识非常重要。

这篇文章极好，反老师牛人也！