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蛋白纯化过程中沉淀的形成影响因素

已有 98 次阅读2018-6-11 16:56 |个人分类:蛋白表达与纯化| 重组蛋白纯化, 蛋白纯化, 蛋白分离纯化, 蛋白变性, 沉淀

生物分子的分离纯化是获得有效生物产品的重要环节之一,在重组蛋白纯化过程中需要考虑目的物性质,合理选择及组合具有各自特点及优势的层析技术,才能达到最优的纯化效果,满足目标产品产量、纯度等多方面的要求。蛋白的分离纯化及制备过程中,会产生沉淀,这些沉淀有可逆和不可逆2种。

蛋白发生变性,指的是蛋白分子在遭到剧烈的物理化学(如高温,极端pH)作用时,分子中的次级键遭到破坏断裂,导致空间构象从紧密有序的变为松散无序的状态,这种清况下形成的沉淀是不可逆的。在蛋白盐析、蛋白等电沉淀中最为常见的是蛋白质的水化膜遭到破坏或者中和了表面的净电荷后形成的沉淀,这种情况下形成的沉淀是可逆的,利用这一特性可以用来分离纯化蛋白。

若发生可逆沉淀后,可以尝试通过增加溶剂,调节pH,添加助溶剂等方式来处理;若发生不可逆沉淀,则可以选择离心,过滤等方式去除。一般下列因素会影响蛋白纯化过程中沉淀的形成。

1、影响蛋白纯化过程中沉淀形成的影响因素

1)蛋白自身性质

如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易发生疏水聚合而沉淀,做过膜蛋白提取以及包涵体溶解时都有切身体会。在表达还有二硫键键的蛋白时特别容易形成包涵体蛋白,所以蛋白的氨基酸序列中,含硫氨基酸较多时也容易形成沉淀。

2pH

蛋白质大多数都在高pH时溶解性高,低pH时易沉淀,这可能与氢键的形成有关。但有时候更低pH时蛋白又溶解了,这一现象在我们用亲和层析纯化抗体时特别常见。盐浓度就是盐析效应,高浓度的盐破坏蛋白的水化层,使得蛋白质聚集沉淀,常用的就是硫酸铵沉淀。盐析沉淀通常对蛋白质的高级结构没有破坏,再溶时活性可以完全恢复。常见的例子就是硫酸铵沉淀纯化IgG。同样,硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况,例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。

3)有机溶剂

例如丙酮沉淀,但有机溶剂也不是全部对蛋白起沉淀作用,有时候也有助溶作用。例如有些膜蛋白的有机溶剂抽提。

4)温度

高温或低温都有可能使得蛋白质沉淀。煮沸沉淀常见了,低温沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。

5)表面活性剂
对蛋白质有助溶作用。例如做电泳的SDS就是很强的表面活性剂,还有TWEENTriton等等。

6)还原剂

还原剂往往对蛋白质有助溶作用。有些蛋白当加入的还原剂在空气中慢慢氧化后,就会沉淀析出。变性剂如尿素、盐酸胍,包涵体蛋白在用变性剂溶解后,再去除变性剂经常会沉淀析出。

2、利用可逆沉淀纯化蛋白

在蛋白质水溶液中,加入了高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等而使蛋白质从溶液中析出,称为盐析。

在确定蛋白的pI后,用弱酸/弱碱(如碳酸钠等)缓慢滴加到蛋白溶液中,使溶液pHpI一致,即可沉淀出目标蛋白,称为等电沉淀。

3、避免不可逆沉底的发生

对温度敏感型蛋白的纯化制备尽可能在4度的环境中进行。蛋白溶液在透析脱盐时尽可能的避免体系剧烈变化,可梯度透析。

亲和层析纯化蛋白时,大多需要较低的pH洗脱,在收集洗脱峰的容器中垫缓冲液(常用1MTris),让洗脱下来的蛋白迅速恢复到中性环境。

总而言之,在蛋白纯化及制备过程中,选择温和的操作环境,换缓冲液等过程要缓慢,避免剧烈操作。另外在制备过程中也可以尝试加一些增溶剂,尿素,精氨酸等。也可尝试加还原剂DTTB-ME等。也可以加EDTA避免蛋白的降解。


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